Муковисцидоз представляет собой генетическое заболевание, возникающее вследствие мутации в гене CFTR (трансмембранного регулятора) в длинном плече седьмой хромосомы. Является аутосомно-рециссивной патологией, которая сопровождается сгущением секрета, отделяемого из желез внешней секреции, а также нарушением его выведения.
Какие клинические симптомы характерны для заболевания?
Клиника муковисцидоза проявляется с раннего возраста. Чем раньше по времени возникают изменения, тем хуже прогноз. Так как поражаются экзокринные железы, то изменениям подвержены практически все системы организма больного человека. При этом одним из наиболее значимых симптомов заболевания является поражение органов дыхательной системы. Появляются гнойное отделяемое, отдышка из-за обструкции бронхов, характерны частые респираторные инфекции. Помимо изменений в дыхательной системе, избыток слизи наблюдается в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), также поражаются другие органы, в том числе печень, поджелудочная железа и прочее, что сопровождается характерными симптомами и диспепсическими проявлениями. При муковисцидозе повышается соленость пота за счет высокого содержания в нем натрия и хлора.
Таким образом, основными симптомами при муковисцидозе являются:
- кашель;
- инфекционно-воспалительные заболевания легких и бронхиального древа;
- отдышка;
- тошнота, рвота, зловонная диарея;
- вздутие живота;
- отставание в развитии из-за дефицита питательных веществ;
- задержка полового развития;
- симптомы «барабанных палочек» и «часовых стекол», как проявление дыхательной и сердечной недостаточностей.
В зависимости от возраста преобладающий симптом может меняться, при этом заболевание характеризуется совокупностью различных проявлений.
Как диагностировать заболевание? Какие анализы нужно сдать на муковисцидоз?
Диагностируют болезнь на основании данных лабораторных исследований, функциональных проб, а также данных физикального осмотра и инструментальных методов исследования
Какие лабораторные исследования проводят?
1. Исследование сухого пятна крови на иммунореактивный трипсин
Так как заболевание является наследственным, то для ранней диагностики у детей в роддоме проводят анализ на муковисцидоз. Для этого на 4 день жизни у доношенного ребенка берут кровь из пятки и наносят ее на специальную бумагу. После получения сухого пятна в лаборатории проводят исследование количества иммунореактивного трипсина, который повышен при муковисцидозе. При выявлении гипертрипсиногенемии повторный анализ проводят на 4 неделе жизни младенца. При получении второго измененного результата исследования назначается потовый тест.
2. Потовый тест
При муковисцидозе концентрация электролитов в выделяемой потовой жидкости увеличивается. Поэтому для диагностики заболевания проводят потовый тест, который позволяет определить количество электролитов. Для исследования проводят электрофорез с пилокарпином (лекарственный м-холиномиметик, усиливающий потоотделение), после чего с помощью специального датчика анализируется выделенный пот. Нормальная концентрация ионов у здорового ребенка не должна превышать значения 35-40 ммоль/л. При этом достоверным изменением при муковисцидозе является уровень, превышающий 60-70 ммоль/л. Чтобы подтвердить диагноз и считать тест диагностически значимым, необходимо трехкратное его проведение с получением соответствующих результатов.
3. Генетическое исследование (метод ПЦР)
Для выявления мутации в гене CFTR используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Исследование рекомендовано при положительно потовой пробе, а также при наличии патологии у родственников. ПЦР является высокотехнологичным методом молекулярной биологии, который используется для выявления возбудителя при различных вирусных и бактериальных инфекциях, выявления генных мутаций, установления родства и прочее. Он основан на многократном увеличении числа копий генетического материала с его последующим изучением. Для проведения реакции подготавливают реакционную смесь, которая состоит из:
- исследуемого участка ДНК (матрицы);
- праймеров, которые являются искусственно синтезированными короткими нуклеотидными последовательностями, комплементарными концам цепей фрагмента ДНК;
- нуклеозидтрифосфатов для построения новой цепи ДНК, каждый из которых состоит из остатков фосфорной кислоты, основания (аденина, гуанина, цитозина или тимина) и дезоксирибозы (сахара);
- фермента ДНК-полимеразы;
- буферной смеси оптимальной для проведения реакции.
В ходе ПЦР выполняют около 25-30 циклов. При этом каждый цикл реакции состоит из трех последовательных этапов:
- Денатурация
На первом этапе полимеразной цепной реакции необходимо создать условия для расхождения нитей двуцепочечной молекулы ДНК. Для этого материал нагревают до 94-98°С, что способствует разрушению водородных связей.
- Отжиг
Следующим этапом реакции является отжиг. После расхождения каждая цепь молекулы ДНК становится матрицей для синтеза новой. Однако для начала репликации (удвоения) необходимо, чтобы к каждой из матриц присоединился праймер. Для этого температуру снижают до значений на 5 градусов ниже температуры плавления праймера, обычно до 60-72°С.
- Элонгация
После прикрепления праймера к матричным цепям ДНК начинается достраивание новой нуклеотидной цепи по принципу комплементарности. Используются нуклеотиды из реакционной смеси. Процесс происходит под действием фермента – ДНК-полимеразы при оптимальной температуре 72°С.
После прохождения всех этапов цикл повторяют. При этом в качестве матрицы используются и вновь синтезированные молекулы.
Метод ПЦР имеет множество модификаций, каждая из которых используется в своих целях. Муковисцидоз может быть связан с различными мутациями в гене, поэтому при генетическом исследовании оценивают все значимые маркеры. Для диагностики муковисцидоза используют метод мультиплексной ПЦР, который основан на множественной амплификации разных последовательностей ДНК в одной пробирке. Кроме того, применяют ДНК-микрочипы, которые представляют собой матрицу с определенными фрагментами ДНК. К биочипу добавляют меченые последовательности изучаемого материала, ждут некоторое время и промывают чип. В случае гибридизации комплементарных цепей, то есть соединения пробной цепи и исследуемой молекулы ДНК, будет характерное свечение, что укажет на конкретную мутацию.
4. Анализ кала (в том числе на эластазу)
Помимо вышеперечисленных методов косвенно судить о наследственной патологии позволяют результаты копрологического исследования. Проводят макроскопический анализ – оценку цвета, консистенции, запаха, примеси крови и слизи, а также микроскопическое исследование. При муковисцидозе повышено содержание нейтрофильного жира, что связано с нарушением работы поджелудочной железы. Возможно нарушение пищеварения и в других отделах ЖКТ, что может сопровождаться присутствием непереваренных мышечных волокон в кале, клетчатки, крахмала и т.д.
Кроме того, исследуют количество панкреатической эластазы в кале. Эластаза представляет собой протеолитический фермент, который позволяет оценить внешнесекреторную активность поджелудочной железы. При муковисциозе наблюдается экзокринная недостаточность органа, что сопровождается снижением количества эластазы в кале ниже нормальных значений (менее 200 мкг/г).
Сколько делается анализ на муковисцидоз?
В зависимости от вида лабораторного исследование срок исполнения может сильно различаться. В каждом конкретном случае уточняйте информацию отдельно.
Где сдать анализы на муковисцидоз?
В настоящее время анализ на муковисцидоз является обязательным и входит в перечень исследований неонатального скрининга новорожденных. Таким образом, первичный анализ проводится в роддоме. В свою очередь генетическое исследование на определение мутации в гене CFTR возможно провести в лаборатории ДЦЛИ в Москве. Любую информацию относительно лабораторной диагностики заболевания Вы можете найти на сайте лаборатории https://pmu.dcli.ru/ или уточнить по номеру телефона.